實時熒光定量 PCR 儀檢測肉類微生物主要基于聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)，并結(jié)合熒光檢測方法，能夠?qū)θ忸愔械奈⑸镞M行定性和定量分析，具體操作步驟如下：

        樣品采集與處理：從肉類樣品的不同部位采集適量樣本，放入無菌容器中。將采集的樣品進行均質(zhì)處理，使微生物均勻分散在溶液中。然后采用合適的核酸提取方法，如試劑盒法，從樣品中提取微生物的核酸（DNA 或 RNA）。對于 RNA 病毒等含 RNA 的微生物，還需要進行逆轉(zhuǎn)錄過程，將 RNA 轉(zhuǎn)化為 cDNA。

        引物和探針設(shè)計：根據(jù)目標微生物的特定基因序列，設(shè)計特異性的引物和熒光探針。引物是一段短的 DNA 序列，能夠與目標基因的兩端互補配對，引導 DNA 聚合酶進行擴增；熒光探針則是一段與目標基因中間部分互補的寡核苷酸，兩端分別標記有熒光報告基團和淬滅基團。當探針完整時，熒光報告基團發(fā)出的熒光被淬滅基團吸收；而當探針被降解時，熒光報告基團與淬滅基團分離，發(fā)出熒光。

        配制反應(yīng)體系：在 PCR 反應(yīng)管中依次加入適量的模板核酸（提取的微生物核酸或 cDNA）、引物、熒光探針、DNA 聚合酶、dNTPs（脫氧核苷三磷酸）、緩沖液等，組成 PCR 反應(yīng)體系。確保各成分的濃度和比例合適，以保證 PCR 反應(yīng)的順利進行。

        設(shè)置反應(yīng)條件：將 PCR 反應(yīng)管放入實時熒光定量 PCR 儀中，設(shè)置合適的反應(yīng)程序。一般包括預(yù)變性步驟，使 DNA 雙鏈解開；然后進行多個循環(huán)的變性、退火和延伸步驟。變性是使 DNA 雙鏈分離，退火是讓引物與模板 DNA 結(jié)合，延伸是在 DNA 聚合酶的作用下合成新的 DNA 鏈。在每個循環(huán)的延伸階段，熒光探針會被 DNA 聚合酶降解，釋放出熒光信號，實時熒光定量 PCR 儀會實時監(jiān)測熒光信號的強度。

        數(shù)據(jù)分析與結(jié)果判斷：隨著 PCR 反應(yīng)的進行，熒光信號會逐漸增強。實時熒光定量 PCR 儀會自動記錄每個循環(huán)的熒光值，并生成擴增曲線。通過分析擴增曲線的 Ct 值（循環(huán)閾值，即熒光信號達到設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），可以對目標微生物進行定性和定量分析。一般來說，Ct 值越小，說明樣品中目標微生物的核酸含量越高。同時，通過與已知濃度的標準品的擴增曲線進行比較，還可以計算出樣品中目標微生物的具體數(shù)量。如果樣品的擴增曲線呈現(xiàn)典型的 S 型曲線，且 Ct 值在合理范圍內(nèi)，則判定樣品中存在目標微生物；如果沒有擴增曲線或 Ct 值大于設(shè)定的閾值，則判定樣品中不存在目標微生物或微生物含量低于檢測限。

        實時熒光定量 PCR 儀檢測肉類微生物具有靈敏度高、特異性強、檢測速度快等優(yōu)點，能夠快速準確地檢測出肉類中可能存在的致病菌、腐敗菌等微生物，為肉類食品安全提供有力保障。

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